廢水污泥中鄰苯二甲酸酯降解菌的多樣性
隨著增塑劑PAEs在日用品、建材、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)的廣泛應(yīng)用，其在環(huán)境中的殘留、分布及其對生態(tài)系統(tǒng)的危害日益受到關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上鄰苯二甲酸酯的年消費(fèi)量高達(dá)680萬噸。由于PAEs和化合物的結(jié)合是物理的，所以很容易釋放到環(huán)境中。這種釋放過程可能發(fā)生在塑料產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用和處置過程中。目前，PAEs存在于土壤、河水、海水、沉積物和生物群中，其在環(huán)境中的長期存在會對生物產(chǎn)生毒性作用。鄰苯二甲酸酯廣泛用于鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)。由于其致癌性、致畸性和致突變性，DBP和DEHP已被美國環(huán)境保護(hù)局列為優(yōu)先污染物。
土壤、河水、海水甚至飲用水源中的PAEs污染與污水處理和排放密切相關(guān)。目前我國污水排放標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了常規(guī)生化指標(biāo)和重金屬含量，但PAEs等有機(jī)污染物不在其中。因此，即使污水達(dá)標(biāo)排放，PAEs仍會隨污水進(jìn)入水環(huán)境系統(tǒng)，對周圍土壤造成污染。
在我國，除了農(nóng)業(yè)大棚和塑料薄膜的使用會直接造成PAEs對土壤的污染外，大部分含有PAEs的塑料制品廢棄物都是通過垃圾堆放、填埋以及后期污水處理進(jìn)入環(huán)境的。生活垃圾、醫(yī)療垃圾和工業(yè)垃圾長期堆放后，PAEs會從塑料制品中釋放出來，并被雨水沖刷到垃圾滲濾液中。包括垃圾滲濾液在內(nèi)的多種污水是PAEs的主要聚集地，只有在污水處理環(huán)節(jié)有效去除PAEs，才能避免PAEs對周圍環(huán)境的二次污染。污水處理中的生物降解是去除各種有機(jī)污染物的關(guān)鍵因素。目前，關(guān)于污水處理系統(tǒng)中鄰苯二甲酸酯降解菌的多樣性以及鄰苯二甲酸酯對污水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響的報道較少。本研究系統(tǒng)探索了常規(guī)污水處理污泥對典型鄰苯二甲酸酯的微生物群落響應(yīng)特征以及污泥中鄰苯二甲酸酯降解菌的多樣性，為鄰苯二甲酸酯降解菌的實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
一.材料和方法
1.1污泥取樣
處理后的污泥取自浙江紹興某污水處理廠好氧池，該廠長期處理化工和印染廢水。新鮮污泥樣品經(jīng)沉淀、離心脫水后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2主要培養(yǎng)基和試劑
鹽培養(yǎng)基:1.00g/LKH2PO4，7.04g/lna 2 hpo 4 & # 8226；12H2O，0.10克/升gcl 2 & # 8226；6H2O，微量元素母液1mL，pH7.2。
微量元素母液:2.1385克/硫酸亞鐵& # 8226；7H2O，0.1g/LZ NSO 4 & # 8226；7H2O，0.03克/lmn cl 2 & # 8226；4H2O，0.3g/LH3BO4，0.2868g/lcoc L2 & # 8226；6H2O，0.02克/升氯化鋰& # 8226；6H2O，0.03g/lna 2 moo 4 & # 8226；2H2O，pH4.0 .
DBP和DEHP為色譜級試劑，其他試劑為分析純試劑。
1.3 PAEs降解菌的富集培養(yǎng)
對DBP和DEHP分別進(jìn)行增菌培養(yǎng)。各組實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下:將5g廢水處理污泥置于200mL堿性鹽培養(yǎng)基中，加入100mg/LDBP或DEHP作為碳源，在30℃、200r/min的搖床中放置5天，然后轉(zhuǎn)移到含400mg/LDBP或DEHP的堿性鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天，然后連續(xù)轉(zhuǎn)移兩輪(DBP或DEHP的質(zhì)量濃度梯度為700
1.4 DNA提取和序列擴(kuò)增
用十六烷基三甲基溴化銨法提取樣品的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。將樣品DNA稀釋至1 ng/μ l，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶條形碼的特異性引物、帶GC緩沖液的Phusion高保真PCR Master Mix和新英格蘭BiGolabs公司的高效高保真酶進(jìn)行PCR，保證擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增引物序列和相應(yīng)區(qū)域見表1。
1.5 Hiseq測序和數(shù)據(jù)處理
使用Thermofisher公司的ionplusfragmentlibrarykit 48 rxns試劑盒構(gòu)建文庫。量子位量化和文庫檢測后，在計(jì)算機(jī)上用IonS5TMXL對文庫進(jìn)行測序。用Cutadapt(V1.9.1)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行部分切割，然后將條形碼和引物序列切掉，初步得到原始數(shù)據(jù)。去除原始序列中的嵌合體序列后，得到最終的有效數(shù)據(jù)。
1.6數(shù)據(jù)分析
1.6.1可操作分類單元(OTUs)聚類和物種注釋
使用Uparse軟件(Uparsev7.0.1001/)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，將具有97%或更高一致性的序列分類為一個OTUs。采用Mothur方法和SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs的代表序列進(jìn)行注釋，獲得分類信息，并在界、門、綱、目、科、屬、種水平上統(tǒng)計(jì)群落組成。
1.6.2群體間群落相似性分析
根據(jù)測序數(shù)據(jù)和OTUs聚類分析結(jié)果，用Qiime軟件計(jì)算Unifrac距離，用未加權(quán)組平均法進(jìn)行樣本聚類分析。利用R軟件的ade4軟件包和ggplot2軟件包進(jìn)行主成分分析，以反映群體間群落的相似性，并分別進(jìn)行參數(shù)和非參數(shù)檢驗(yàn)。選擇Tukey和wilcox檢驗(yàn)作為檢驗(yàn)方法。
1.6.3植物區(qū)系豐度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析
首先用Qiime軟件(1.9.1版)計(jì)算菌群多度指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)。然后用R軟件分析菌群多度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性，并分別進(jìn)行參數(shù)和非參數(shù)檢驗(yàn)。選擇Tukey和wilcox檢驗(yàn)作為檢驗(yàn)方法。
二。結(jié)果和討論
2.1 DBP和DEHP的降解效率
實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過四輪富集培養(yǎng)后得到的富集菌液對DBP和DEHP具有良好的降解效果。富集菌液對DBP和DEHP的降解效率見圖1。當(dāng)DBP和DEHP為1000mg/L時，培養(yǎng)第6天，DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到57.1%和36.0%。培養(yǎng)10天后，富集菌液對DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，與文獻(xiàn)一致，原因是DEHP比DBP含有更復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)。
據(jù)介紹，DBP和DEHP的降解從酯水解開始，形成中間體單酯(鄰苯二甲酸丁酯或鄰苯二甲酸乙酯)和相應(yīng)的醇，單酯進(jìn)一步降解為鄰苯二甲酸。由于兩個酯鏈中的每一個都多了一個支鏈，增加了DEHP降解成單酯的難度，這是其降解速率比DBP慢的主要原因。
2.2污泥菌群豐富度及類群間群落相似性分析
分別取原污水處理污泥(簡稱RS群)和經(jīng)DBP和DEHP降解菌富集培養(yǎng)后的污泥(簡稱DBP和DEHP群)進(jìn)行Hiseq測序。OTUs聚類分析顯示DBP、DEHP和RS組的OTUs數(shù)量明顯低于RS組，DBP、DEHP和RS組的OTUs數(shù)量分別為226、273和848個。三個樣本組的OTUs總數(shù)為205。DBP組和DEHP組的OTUs重疊率分別為90.7%和75.1%，而RS組僅有24.2%。結(jié)果進(jìn)一步表明，DBP和DEHP的加入顯著降低了富集培養(yǎng)過程中污水處理污泥中的微生物多樣性。
本研究進(jìn)一步開展了OTUs代表序列的物種注釋和群落相似性分析?；贠TUs級別的PCA如圖2所示。樣本的群落組成越相似，它們在主成分分析中的距離就越近。DBP類群和DEHP類群的物種組成相似，但都與RS類群有較大差異。
2.3污泥中優(yōu)勢菌群和PAEs降解菌的分布
根據(jù)植物區(qū)系多度分析的結(jié)果，選擇相對多度最高的10個優(yōu)勢種(見表2)，詳細(xì)顯示不同樣品組的物種多度。變形菌和擬桿菌在所有樣品組中都占優(yōu)勢，RS組的相對豐度低于DBP和DEHP組。在RS組中，放線菌的相對豐度也較高。Unifrac距離分析表明，DBP與DEHP類群的物種多度和優(yōu)勢類群相似，而DBP與DEHP類群和RS類群的相似性較低。
為了探索鄰苯二甲酸酯降解菌在污泥中的分布，從DBP、DEHP和RS類群中的前35個屬中篩選出具有DBP或DEHP降解能力的報道屬。結(jié)果如表3所示。在DEHP群中，DEHP降解細(xì)菌被報道存在于戈登氏菌屬、無色桿菌屬、紅球菌屬、根瘤菌屬和黃單胞菌屬中；在DBP組中，DBP降解細(xì)菌被報道存在于優(yōu)勢屬Delft、假單胞菌和鞘脂中。戈登氏菌屬、紅球菌屬和根瘤菌屬中也有DBP降解菌的報道，這表明許多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同時具有DBP降解能力，而另一些不具有同時降解DBP和DEHP的能力，這進(jìn)一步表明DEHP比DBP更難降解，這一結(jié)果與DEHP更復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。鑒于DEHP更難降解，如果微生物能有效降解DEGHP，那么它們更容易降解結(jié)構(gòu)相似、結(jié)構(gòu)不復(fù)雜的DBP。系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析表明，已報道的PAEs降解菌存在于多個優(yōu)勢屬中，它們之間沒有明顯的進(jìn)化關(guān)系。這一結(jié)論與已報道的研究結(jié)論一致，即PAEs降解菌在自然環(huán)境中具有較高的遺傳多樣性。以上結(jié)果表明，污水處理污泥中存在多種類型的PAEs降解菌。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷生長，進(jìn)而成為優(yōu)勢微生物，最終實(shí)現(xiàn)DBP和DEHP的有效降解。然而，低濃度鄰苯二甲酸酯的污染仍然會引起各種遺傳損傷。因此，復(fù)雜環(huán)境中低濃度鄰苯二甲酸酯的去除仍然是一個亟待解決的重要問題。
三。結(jié)論
(1)經(jīng)過10天的培養(yǎng)，1000mg/L廢水處理污泥的DBP和DEHP降解率分別可達(dá)99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP的降解速率。
(DBP和DEHP的加入顯著降低了污水處理污泥的微生物多樣性。DBP和DEHP類群的物種組成相似，但與RS類群有所不同。
(3)污水處理污泥中PAEs降解菌種類繁多。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷生長，進(jìn)而成為優(yōu)勢微生物，最終實(shí)現(xiàn)DBP和DEHP的有效降解。(來源:浙江科技學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院、浙江省廢棄物生物質(zhì)資源化與生態(tài)處理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院)
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